Los componentes sanguíneos celulares (glóbulos rojos, plaquetas, y granulocitos) contienen leucocitos contaminantes que producen en el receptor reacciones de tipo inmunológico tales como aloinmunización, enfermedad injerto vs huésped (EIVH), y inmunomodulación, y transmisión de enfermedades infecciosas como el citomegalovirus (CMV), HTLV-I, EBV (virus de Epstein-Barr) y otras infecciones virales (1).

El plasma fresco congelado (PFC) y el crioprecipitado (CP) son considerados componentes acelulares o con muy poco contenido de leucocitos para desencadenar estas complicaciones en un paciente inmunocomprometido (2).

Actualmente existe controversia al respecto ya que diferentes estudios demuestran que los leucocitos están presentes en el PFC en suficiente cantidad y con suficiente viabilidad para causar EIVH asociado a la transfusión (2-4). Sin embargo existe en la literatura solo un reporte que asocia leucocitos pasajeros en el PFC como la probable causa de EIVH asociado a la transfusión (5).

La transmisión de CMV a través de glóbulos rojos y glóbulos blancos ha sido bien documentada (6-8). Estos componentes son una importante fuente de transmisión de CMV especialmente para los pacientes inmunocomprometidos, por tal motivo se ha sugerido que la remoción de leucocitos de sangre alogeneica puede prevenir la infección por CMV asociado a la transfusión (9,10). Hasta ahora solo hay reportada evidencia clínica de que los componentes plasmáticos no son una fuente de CMV (11-17).

El propósito de este estudio fue el determinar si el recuento y la viabilidad de los leucocitos contaminantes en el PFC hacen necesario la filtración e irradiación de este componente para la prevención de complicaciones asociadas a la transfusión en pacientes inmunocomprometidos.

Se recolectaron 50 unidades de sangre procedentes de 50 donantes que cumplieron todos los requisitos exigidos por el The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center para la donación. Antes de 6 horas se separo el plasma de los glóbulos rojos en una centrifuga refrigerada RC-3B. La unidad se centrifugo a 1700 x g durante 5 minutos, obteniéndose plasma rico en plaquetas. Posteriormente se realizo una segunda centrifugación a 4800 x g durante 5 minutos para obtener el concentrado plaquetario.

El plasma fue extraído normalmente por presión y posteriormente congelado a –18ºC. El peso de las unidades oscilo entre 127 gm y 263, con un promedio de 212 gm.

Se filtraron 20 unidades a través de filtros de leucodepleción para glóbulos rojos Sepacell (Baxter, Deerfield, IL). El proceso de filtración se realizo a temperatura ambiente con una duración menor a 5 minutos por unidad filtrada. Se filtraron 4 unidades por filtro y no se utilizo solución salina para purgar el filtro. En el empleo del filtro se siguieron las recomendaciones del fabricante.

El recuento de leucocitos prefiltración y postfiltración se realizo manualmente a través de cámara de Nageotte. Durante el procedimiento se utilizo la solución de Turk que permitió la visibilidad del núcleo de los leucocitos mediante el uso de un ocular 10x con objetivos de 10x y 40x en un microscopio convencional (18). En el empleo de la técnica se siguió la metodología habitual.

Se realizo citometría de flujo en 10 unidades de PFC. Cada unidad fue descongelada en un baño térmico a 37ºC y el componente celular fue recuperado por centrifugación a 500 x g a 4ºC durante 20 minutos. Posteriormente se descarto el sobrenadante hasta obtener un volumen de 50 cc. Las células fueron contadas en un contador automático de células (Coulter, Miami, FL). El inmunofenotipo fue realizado por un equipo de citometría de flujo tricolor standard usando anticuerpo monoclonal obtenido comercialmente (Becton-Dickinson Inmunocytometry Systems, San Jose, CA). Fueron usados los siguientes anticuerpos: Leu4 (CD3), Leu3 (CD4), Leu2 (CD8), Leu12 (CD19), Leu1 (CD5), LeuM1 (CD15), CD41, CD13, CD33, CD45, and LeuM3 (CD14). El plasma fue dividido en 7 tubos y centrifugado para concentrar las células. El sobrenadante fue descartado y las células fueron resuspendidas. Las células fueron incubadas con 10 µL de anticuerpos a 2-8ºC por 15 minutos en la oscuridad, seguido por dos lavados con una solución de buffer fosfato. Luego las células fueron resuspendidas y fijadas con paraformaldehido al 1%, y analizadas en un FACScan (Becton-Dickinson) usando un programa de CellQuest (Becton-Dickinson). Linfocitos, monocitos, plaquetas, y granulocitos fueron discriminados basados en la densidad de CD45 y el patrón característico de la dispersión de los rayos láser en la superficie celular. El punto de cutoff se hizo visualmente a un nivel por encima del campo de positividad usando controles de isotipo.

En este procedimiento se utilizaron muestras procedentes de 20 unidades de PFC. Cada espécimen fue evaluado para la presencia de CMV humano mediante detección de antígeno fluorescente directo, usando anticuerpo monoclonal para la proteína estructural CMVpp65 y métodos basados en cultivo. El PFC fue descongelado rápidamente en un baño térmico a 35ºC y el componente celular fue recuperado por centrifugación a 200 x g durante 10 minutos a 4ºC.

La detección de antígeno fue realizada usando la prueba de antigenemia de CMVpp65 de Chemico Internacional (Temecula, CA). Las células fueron lavadas en solución salina con buffer fosfato y los eritrocitos fueron lisados con cloruro de amonio frío. Cuatrocientos cincuenta mililitros de PFC tuvieron un rendimiento promedio de 1 x 10³ células. Las laminillas fueron teñidas e interpretadas siguiendo la metodología del procedimiento.

Para métodos basados en cultivo 2 ml de sobrenadante residual fue usado para inocular 2 MRC5 "shell vial" (cada una se inoculo con 0,5 ml) y 2 líneas celulares diploides de fibroblasto de prepucio humano (células SF, inoculadas con 0,5 ml cada una). Los "shell vials" fueron incubados por 18-24 horas y leídos usando la tintura para CMV de Bartels (Issaquah, WA) y las células SF fueron leídas para efecto citopático por 21 días (19).

Del total de 50 unidades de PFC recolectadas, 20 fueron analizadas para recuento de leucocitos prefiltración y postfiltración a través de cámara de Nageotte. Veinte unidades fueron a cultivo para CMV, y a las 10 unidades restantes se les estudió por citometría de flujo.

La Tabla 1 muestra el promedio de los resultados obtenidos con el recuento de glóbulos blancos pre- y postfiltración a través de cámara de Nageotte. El promedio de leucocitos prefiltración fue de 1,68 x 10⁶ (rango, 0,11-3,5 x 10⁶) y postfiltración 0,0019 x 10⁶ (rango, 0,00063-0,01 x 10⁶). El porcentaje de remoción a través del filtro de leucodepleción fue del 98,52% (rango, 96,75-99,99%). El promedio de leucocitos obtenidos en cámara de Nageotte fue comparativamente mas alto que el obtenido por citometría de flujo. Por este método el promedio fue de 0,19 x 10⁶ (rango, 0,03-0,29 x 10⁶).

Tal como lo muestra la Tabla 2, el análisis de los glóbulos blancos demuestra un promedio de 10,9% de linfocitos (rango, 2-25%), 3,8% de granulocitos (rango, 1-10%), y 5% de monocitos (rango, 1-10%). El porcentaje promedio de los CD4 fue mayor que el de CD8 y CD19 (CD4 = 4,23%, CD8 = 2,2%, CD19 = 2,65%). La mayor cantidad de células corresponde a las plaquetas con un promedio de 16,57 x 10⁶ (rango, 14-18,6 x 10⁶). Ninguna de las muestras analizadas por cultivo demostró la presencia de CMV.

Tabla 2. Resultados Obtenidos a Través de Citometría de Flujo

Algunos autores han demostrado la presencia de un gran numero de leucocitos en el PFC preparado por diferentes técnicas. Willis et al. (4) reportaron mas de 1 x 10⁶ leucocitos por unidad, Bernvil et al. (2) encontraron un promedio de 2 x 10⁶, y Wieding et al. (3) reportaron 3,2 x 10⁶. Además se ha demostrado que estos leucocitos a pesar del proceso de congelación y descongelación conservan su viabilidad y capacidad de proliferación (3).

Los resultados obtenidos en nuestro estudio son comparables a los obtenidos por estos autores y demuestran también la presencia de un gran numero de leucocitos (1,68 x 10⁶) y plaquetas (16,56 x 10⁶) que podrían representar complicaciones en la transfusión de pacientes inmunocomprometidos tales como refractariedad a la transfusión plaquetaria, EIVH, y reacción febril transfusional no hemolítica.

Los cultivos fueron negativos para CMV probablemente debido al proceso de congelación. Además el CMV es rara vez obtenido de los glóbulos rojos, glóbulos blancos, o fracciones plasmáticas de donantes de sangre inmunocompetentes. La viremia ocurre solo en pacientes inmunocomprometidos o durante los primeros días después de una infección primaria (20).

En conclusión, el PFC no debe ser considerado como un componente acelular ya que, a pesar de las diferentes técnicas de preparación, posee suficientes numeros de leucocitos y plaquetas que lo hacen susceptible de producir complicaciones transfusionales en pacientes inmunocomprometidos. Por tal motivo, la filtración e irradiación de este componente debería ser indicada en este tipo de pacientes.

Bibliografía

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